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在酸性条件下,考马斯亮兰g-250染料与蛋白质疏水区结合,导致da吸收峰由465 nm 变为595 nm,同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。该法操作简便迅速,消耗样品量少,但不同蛋白质之间差异大,且标准曲线线性差。将蛋白质样品或稀释的bsa 与bradford试剂混合,测量在595 nm处的吸收值,在建立由一系列稀释的bsa建立的标准曲线的情况下,蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。
考马斯亮蓝g-250coomassie brilliant blue g-250测定蛋白质含量属于染料结-的一种。考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉。在游离状态下呈红色,da光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有da光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝g-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/ml,xaio可测2.5μg/ml蛋白质,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。?电泳结束后,取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中,微波炉加热至接近沸腾或-沸腾,立即停止加热。
考马斯亮蓝有g250和r250两种。其-马斯亮蓝g250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝r250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
? 1.?常规染色脱色方法:
? a.?电泳结束后,取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中,-染色液可以充分覆盖凝胶。
?b.?置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动,室温染色1小时或更长时间。197542090性状红紫色均匀粉末或颗粒,有金属光泽,无臭。? 注:具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚,温度较低,则染色时间宜适当延长。凝胶较薄,温度较高,则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近,在染色液中几乎看不清凝胶时,可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对终的染色效果产生fu面影响。?
c.?倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
? d.?加入适量考马斯亮蓝染色脱色液,-脱色液可以充分覆盖凝胶。
? e.?置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动,室温脱色4-24小时。4取本品水溶液,做纸上层析,其主色点的rf值应与标准品相同。期间更换脱色液2-4次,直至蓝色背景基本上全部被脱去,并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。? 注:脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸,可以使部分染料吸附在吸水纸上,加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。
? f.?完成脱色后,可以把凝胶保存在水中,用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨,可以把胶保? 存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。?
2.?快速染色脱色方法:?
a.?电泳结束后,取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中,微波炉加热至接近沸腾或-沸腾,立即停止加热。通常对于胶浓度大于10%的胶比较坚韧,在发生煮沸时不易破损;对于胶浓度小于10%的胶,宜尽量避免煮沸,以免出现胶碎裂的情况。
?b.?随后在染色液温度较高的情况下,在室温摇床上摇动5-10分钟。
? d.?加入适量考马斯亮蓝染色脱色液,-染色液可以充分覆盖凝胶。
? e.?微波炉加热至接近沸腾或-沸腾,立即停止加热。
? f.?随后在脱色液温度较高的情况下,在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。
? g.?更换新鲜的脱色液,重复步骤e和步骤f,直至蓝色背景基本上全部被脱去,蛋白条带染色效果达到预期。?
亮蓝运用:
依据在我国《食用添加剂应用标准》gb2760-1996中要求:亮蓝可用作果味型饮料液、固态、水果汁型饮料、碳酸饮料、配制酒、糖块、点心上彩装、红绿丝、水果罐头、浓缩汁、青梅、对虾片,使用量为0.025g/kg;冰激凌,使用量为0.021999g/kg。2.标准曲线蛋白质样本的准备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗ti,可用纯化的抗ti作为标准。红绿丝的使用量可翻倍;果味粉添加剂添加量按稀释液倍率的50%添加
依据在我国《食用添加剂应用标准》gb2760-1996中要求:亮蓝可用作果味型饮料液、固态、水果汁型饮料、碳酸饮料、配制酒、糖块、点心上彩装、红绿丝、水果罐头、浓缩汁、青梅、对虾片,使用量为0.025g/kg;冰激凌,使用量为0.021999g/kg。红绿丝的使用量可翻倍;果味粉添加剂添加量按稀释液倍率的50%添加
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